同型半胱氨酸的检测方法及临床应用

      同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)亦称高半胱氨酸，是甲硫氨酸亦称蛋氨酸代谢过程中产生的一种含硫氨基酸，体内不能合成^[1]。近年来研究表明，同型半胱氨酸与冠心病、脑中风、弥漫性脑动脉硬化、糖尿病肾病等疾病关系甚为密切^[2]。本文就Hcy的代谢、测定方法及临床应用作一综述。

1   Hcy的代谢

1.1  Hcy的理化性质

Hcy又称高半胱氨酸，是一种含硫氨基酸，不属于组成蛋白质的20种氨基酸，体内不能合成，只能来源于蛋氨酸的分解代谢。同型半胱氨酸是一个总称，它包括同型半胱氨酸、双硫同型半胱氨酸（Disulfide homocysteine）和混合同型半胱氨酸-半胱氨酸（Mixed disulfide homocysteine-cysteine）三种形式，正常人体内游离Hcy很少，一般是以蛋白结合形式存在，前者占20%，后者与清蛋白结合，占70-80%^[3]。

1.2  Hcy的代谢过程

Hcy是甲硫氨酸的中间代谢产物，在体内由甲硫氨酸转甲基后生成，有两种去路，一是Hcy可在胱硫醚缩合酶（CBS）和胱硫醚酶的催化下生成半胱氨酸，需要维生素B6（VitB₆）的参与，或经巯基氧化结合生成高胱氨酸，另外Hcy还可在叶酸和维生素B12（VitB₁₂）的辅助作用下再甲基化重新合成甲硫氨酸，此过程需甲硫氨酸合成酶（MS）的催化，并且必须有N5-甲基四氢叶酸作为甲基的供体，后者是四氢叶酸经5，10-甲烯叶酸还原酶（MTHFR）催化而产生^[4]。因此CBS和MS的缺乏或活性丧失可导致代谢通道受阻，血中同型半胱氨酸累积；根据VitB₆反应性，可将CBS和MS的同型半胱氨酸血症分为两类：VitB₆反应型和VitB₆非反应型，二者相比，后者发病早、病情重，较难控制；其它引起同型半胱氨酸血症的原因还包括MTHFR的缺乏，VitB₆、VitB₁₂或叶酸的缺乏^[5]。叶酸、VitB₆和 VitB₁₂是Hcy代谢的重要辅因子，营养因素导致这些维生素的缺乏，导致Hcy 的代谢障碍形成高同型半胱氨酸血症。通过对冠心病患者血浆Hcy水平与叶酸、VitB₁₂ 水平关系的研究表明冠心病患者血浆Hcy水平升高，叶酸、VitB₁₂水平减低，二者呈明显负相关^[6] 。补充叶酸、VitB₆ 和 VitB₁₂ 后，血浆Hcy 水平显著降低。研究发现，VitB₆<200pmol/L 、VitB₁₂<30nmol/L、叶酸 <10nmol/L 可引起高同型半胱氨酸血症。

2   同型半胱氨酸的测定方法

    早期Hcy测定是采用简单的化学试验或第一代氨基酸分析仪，这些方法灵敏度低，可重复性差，往往需要借助蛋氨酸负荷试验或通过测定培养的病人皮肤成纤维细胞中胱硫醚合成酶活性进行诊断。第二代氨基酸分析仪的出现使健康人血浆中的游离Hcy测定成为可能，并由此发现了血浆Hcy和心血管疾病之间有密切联系。近年来采用了高效液相荧光检测和电化学检测方法，因其灵敏度高，可重复性强而被广泛应用。新近，荧光偏振免疫分析方法的应用使Hcy的测定更为方便、灵敏和准确。

2.1  高效液相色谱法（High-Performance Liquid Chromatography ，HPLC）

 HPLC方法多采用柱前衍生化荧光检测技术。由于Hcy在血液中以多种形式存在，所以标本的收集和处理就比较重要，所采集的抗凝血液应立即分离出血浆。Pastore等提出的衍生化方法较为简单，该法的衍生化过程全部在高效液相自动加样器内进行。首先将含有硼氢化钠、二甲基亚砜和氢氧化钠的溶液，含有EDTA和二巯基苏糖醇的溶液，以及1-辛醇，盐酸溶液共同加入标本中，室温下混匀1分钟后，加入含有衍生化试剂bromobimane的缓冲液，混匀1分钟后进样。色谱柱采用150mm×4.6mm的反相C18柱，进样前用pH3.6的硝酸铵和甲酸铵缓冲液平衡，然后用乙腈进行梯度洗脱。半胱氨酸和Hcy的保留时间分别为3.76和4.14分钟。此方法灵敏度高，最低检测限可达50nmol/L，在其线性范围内相关系数r>0.99；批内不精密度为3.3%，批间不精密度为4.9%(n=10)；分离效果好，不仅能分析血液中的多种含硫氨基酸，还能对尿液标本进行测定。

2.2  荧光偏振免疫检测（Fluorescence polarization immunoassay，FPIA）法^[7]

FPIA法灵敏度高，检测速度快，但价格昂贵，故短时间期内不易普及。进行该检测时，首先也要用二巯基苏糖醇将结合型Hcy还原出来，然后通过S腺苷同型半胱氨酸合成酶催化Hcy转变为S腺苷同型半胱氨酸类似物，与特异性单克隆抗体进行竞争性结合，引起示踪物偏光性的改变，从而检测出Hcy的浓度。这种方法检测速度每小时可达20个标本。

2.3  荧光定量法

    使用酶转换法定量血液中Hcy的总浓度，不需要抗体试剂参加反应。首先将氧化态的高半胱氨酸先用dithiothreitol(DTT)还原，再用基因重组酶将同型半胱氨酸分解。所形成产物再与适当显色剂反应形成可测量之荧光化合物。Hcy专用机OP-162将这荧光物质在特定的滤光片波长660nm激发后可在710nm处发出荧光。

2.4  同位素法^[8]

1985年，Refsum等建立该法。该方法通过14 C标记的腺苷与Hcy缩合后，经色谱分离，液体闪烁计数放射强度来测Hcy浓度。该方法灵敏度高，特异性强，但操作繁琐且有放射污染，未能推广使用。

3   Hcy的临床应用

3.1 Hcy与心脑血管疾病

许多研究表明高同型半胱氨酸能引起血管损伤，引起冠状动脉疾病、外周血管疾病、脑血管疾病及静脉血栓形成等多部位血管病变。Hcy与低密度脂蛋白反应经吞噬细胞吞噬^[9]，细胞“破碎”沉积于血管壁，通过一系列反应并有副产物氧化放出，损伤血管壁后，平滑肌细胞分裂修补造成“疤痕”。同时Hcy改变凝血因子水平，造成血小板聚集在血管壁的粥样硬化处等等^[10]。越来越多的临床试验表明高Hcy是冠心病的独立危险因素，降低血浆水平可能降低患者心脑血管事件的发生率^[11]。

3.2 Hcy与慢性肾功能衰竭

    血浆Hcy浓度与肾小球滤过率（Glomerular filtration rate，GFR）呈显著负相关，与血浆肌酐浓度呈显著正相关，随着肾功能损害加重，血浆Hcy水平逐渐升高^[12]。CRF患者普遍存在高Hcy血症，CRF的早期阶段即可出现血浆总Hcy显著增高，出现高Hcy血症的机会是正常人的33倍，血液透析患者高Hcy血症发生率达86%^[13]。CRF患者出现高Hcy血症除了与肾脏对Hcy的代谢和清除障碍有关外，一般认为与该类患者多种营养素摄入不足有关，易出现叶酸、B6、B12等维生素缺乏，影响了Hcy代谢而导致高Hcy血症。

3.3  Hcy与糖尿病肾病

    糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病(DM)主要微血管病变之一，其发病机制复杂，近年来，Ozmen^[14]研究表明其与Hcy水平增高有关。糖尿病患者高Hcy血症的原因是多方面的，其一，糖尿病肾病肾功能下降时，将引起Hcy在体内通过两种途径进行转化，一是Hcy在转化为肤硫醚及半胧氨酸，二是Hcy经过甲基化作用重新形成蛋氨酸循环，此过程需要FA和VitB及亚甲基四氢叶酸(Methylenetetrahydrofolate，MTHFA)的作用。因此，FA、VitBI，、VitB6缺乏和/或Hcy代谢过程中的一些酶的缺陷，均可导致Hcy转化障碍，使在血中堆积，引起高Hcy血症^[15]。何美霞^[16]研究指出，高血清Hcy与 DN的发生密切相关 , Hcy的异常性增高 ,可被认为是糖尿病微血管慢性并发症的重要危险因素。因此 ,对糖尿病患者血Hcy浓度进行监测可为糖尿病微血管性并发症的防治提供理论依据。

综上所述， Hcy可直接或间接地引起血管内皮损害、促进氧化LDL形成、血小板集聚及血管平滑肌细胞增殖等，从而促发动脉粥样硬化的发生，是引起心脑血管不良事件的独立危险因素。同时，Hcy还与肾病、糖尿病肾病等有密切关系。因此，利用分子生物学和生物化学等方法对高同型半胱氨酸血症的形成机理以及它与疾病之间的相互关系进行探讨，是一个十分引人注目的课题。

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