拉米夫定治疗慢性乙型肝炎病毒感染中YMDD变异的观察

     拉米夫定是当前国际公认的对乙型肝炎病毒(HBV)具有确切疗效的抗病毒药物之一，临床应用日益广泛^[1]。但近年来发现长期应用可诱导发生变异，发生变异后常可导致耐药及病情的加重、复发，因此寻找能早期预测发生变异的相关因素，作出相应的防治措施，对提高慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者的临床疗效，改善预后等具有重要的意义，因而成为近年来国内学者们的重要课题。为观察血清HBV DNA定量水平与HBV DNA聚合酶活性区发生变异（YMDD 变异）的关系，选择应用拉米夫定产生变异的CHB患者进行相关研究。

1.1 血清样本收集　2006年8月至2007年12月期间,本院住院及门诊以口服拉米夫定100 mg/d 治疗的106例HBV感染者,其中男性66例,女性40例,年龄16至63岁，平均年龄36.2±18.7岁。诊断依照2000年9月第十次全国病毒性肝炎与肝病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》^[2]标准。治疗时间2周-6个月的43例，7个月-12个月的39例，13-27个月的24例。

1.2 方法

　 乙型肝炎病毒标志物用酶免疫法（ELISA）检测,试剂上海科华公司提供，按说明书操作。

HBV DNA 检测: 采用美国ABI公司7000实时荧光定量PCR仪,  试剂为广州中山医科大学达安基因公司生产,试剂敏感性为1×10³  copies/m l。

　 YMDD 变异检测: 采用PCR 产物的限制性片段长度多态性分析方法^[3] (PCR Restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)。

1.3 统计学处理   变异率用百分率表示，采用Excel软件，率的比较用x²检验，P>0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异不显著。

2．1  106例患者服药前HBsAg、 HBeAg均阳性，按治疗前HBVDNA水平分为四组，如表1。

②与①比较x²=0.25， P>0.05；③与①比较x²=4.05， P<0.05；

④与①比较x²=13.3， P<0.01；③与②比较x²=3.71， P<0.05；

④与②比较x²=14.6， P<0.01；④与③比较x²=5.60， P<0.05。

2．2 HBVDNA YMDD变异率与应用拉米夫定应用时间的关系

    随着拉米夫定应用时间的延长，HBV DNA YMDD变异率逐渐升高，各组间均有明显差异，13-27月组变异率最高，明显高于其他两组。

*  ②与①比 x²=7.19，P<0.05；** ③与①比x²=21.4，P<0.005；

Δ ③与②比x²=5.11，P<0.05；

      拉米夫定近年来已广泛用于临床治疗乙型病毒性肝炎,它通过竞争性抑制HBVDNA 聚合酶及参与新的HBV DNA链合成过程以终止新链合成,从而迅速降低患者体内HBV DNA 浓度, 减轻肝脏炎症, 促进肝功能恢复。但是在临床应用过程中也发现拉米夫定只能阻断HBV复制过程中的中间环节,不能清除肝细胞内及肝外组织细胞中HBV 的复制源ccDNA,同时对整合在人宿主细胞基因的HBV DNA也无能为力。国内外研究发现, 长期使用拉米夫定,可导致HBV DNA突变,突变位点有20多种,目前比较明确与耐药相关的主要是HBV多聚酶活性YMDD基序的变异,即乙肝病毒野生株中蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)替代,形成YVDD或YIDD变异,该部位正是拉米夫定干扰HBV复制的结合位点,该区的基因突变导致相应氨基酸发生改变,空间构象随之改变,拉米夫定无法与之结合,丧失了抗病毒活性。YMDD 变异发生的机理,多数专家认为是由于在拉米夫定治疗前,病人体内即存在变异株和野生株,变异株的复制能力大大低于野生株,当使用拉米夫定治疗时, 野生株复制被抑制,而变异株成为优势株, 并随疗程延长, 变异率呈上升趋势^[4]。

     由于HBV YMDD变异直接影响临床疗效及预后判定, 因此对拉米夫定治疗的患者进行血清HBV DNA变异监测利于指导临床治疗。本文研究结果显示,治疗前HBVDNA水平越高, 拉米夫定治疗后YMDD变异发生率也越高,当HBV DNA > 1×10⁶ copies/ml时,YMDD 变异发生率达36.6%。当HBV DNA > 1×10⁸ copies/m l 时,YMDD变异发生率更高达62.5%。这与临床治疗中较高HBV DNA水平患者拉米夫定治疗后DNA水平下降十分显著,但随后反跳也很普遍的现象相吻合。说明临床拉米夫定治疗过程中,还应参考患者HBV DNA水平来确定治疗方案。

      本文研究结果还显示，应用拉米夫定2-6、7-12及13-27个月的三组患者两两之间变异率均有显著性差异，随着时间延长，三组患者YMDD变异发生率依次增高，分别为。HBV是DNA病毒，其复制需要RNA复制中间体，而RNA复制中间体的生成需要逆转录酶的作用才得以进行，但此酶缺乏校正功能，逆转录过程中易发生核糖核酸的误掺入，因此HBV较其他DNA病毒有更高的变异率，HBV的高复制和逆转录酶缺乏校正功能的特性会时常引起HBVYMDD变异株的产生。拉米夫定的使用增加了促使HBV发生变异的选择压力，随着用药时间的延长，引起病毒变异的选择压力不断积累、加强，HBV发生YMDD变异的机率也随之增高。

     综上所述，YMDD变异的出现与患者治疗前HBVDNA水平相关，越高则变异率越高，用拉米夫定治疗的患者进行YMDD检测有利于指导临床治疗。另外，应用拉米夫定治疗CHB时间越长则发生变异随之增加。这就要求临床改变治疗方案，是否考虑联合应用干扰素降低或延迟变异的发生，这方面的研究正在进行中。

参考文献:

[1]　 于建国，介萍，郭葆玉。慢性乙型肝炎（CHB）抗病毒药物临床应用与现状[J]。临床军医杂志，2002，30（6）：80-81

[2]　 中华医学会传染病与寄生虫学分会、肝病学分会联合修订.病毒性肝炎防治方案[J]。中华肝脏病杂志，2000，8（5）：324-329.

[3]　 Yang D H , Liang W F , Xie Y J ,et al. PCR restriction fragment length polymorphism in detection of YMDD varians of vira polymerase in hepatitis B virus patients treated with lamivudine[J]. Hepatobiliry  Pancreat Dis Int ,2002,1(2):232-237.

[4]　Fontaine H, Thiers V , Chretien Y, et al. HBV genotypic resistance to lamivudine in kidney recipients and hemodialyzed pa2tients[J]. Transplantation, 2000;27: 2090～ 20941.