波长选择对酶标比色计测定结果的影响

      ELISA试验结果的判定无论是定性还是定量分析均应使用酶标比色计进行，较之使用肉眼判读更具有科学性。不同酶标比色计之间的性能存在差异，在波长方面，部分只有单波长（如450nm）比色，部分为双波长（如450nm-630nm）比色。而在结果判定时可有几种选择：①以450nm时的吸光度A值直接计算（A_450nm）；②以450nm时的吸光度A值减去空白（B）孔计算（A_450nm-B）；③以450nm的吸光度A减去630nm吸光度A的差值计算（A_450-630nm）；④以A_450-630nm 减空白B孔计算（A_450-630nm-B）。本文以HBsAg检测为例比较了在选择不同波长比色时对的检测结果的影响，得到受影响较大的主要是临界浓度样本，报道如下。

1.1  样本  取ELISA一步法试剂盒检测HBsAg阳性样本20份，其吸光度A_450-630nm-B均值为0.523(0.307-0.625)。另取HBsAg阳性样本1份，用阴性血清作倍比稀释至临界浓度（本文A值为0.130），备用。

1．2试剂与仪器  检测试剂盒为北京金豪公司产ELISA一步法试剂，HBsAg质控血清购自江苏省临床检验中心（批号0712），浓度1ng/ml。Bio Rad 680酶标比色计，YT-WashⅡ型洗板机。

1.3方法  将HBsAg阳性样本20份用HBsAg试剂盒检测，显色后在四种不同波长选择下比色，连续检测5天，观察最大A值 、最小A值及均值及不同波长下的吸光度A均值。另将经过稀释的临界值样本随日常样本进行检测，设阴性对照（N）、阳性对照（P）及空白对照（B）。每天测定5孔，共检测5天，观察所有25孔样本的最高、最低吸光度A值以及阴阳性样本的例数。四种不同波长分别为：①A₄₅₀；②A_450nm-B；③A_450-620nm；④A_450-620nm-B。所有样本均按说明书严格操作，

2  结果

2.1  四种比色方法得到的A均值及空白孔的结果一并见表1。由表1可见，20例样本测定5天在四种波长下的A值比较接近，最小A值均>0.105,证实在不同波长比色对较高浓度的定性分析结果几无影响。

波长选择            最大A值       最小A值        样本A均值

A450nm              0.636         0.252         0.525            A450nm-B             0.643         0.245         0.523             A450-620nm            0.630         0.284         0.525              A450-620nm-B           0.640         0.310         0.515

 2.2 临界值样本在以上四种波长比色的结果见表2。

波长选择          最大A值       最小A值     A≥0.105     A<0.105

A450nm           0.135         0.114        25         0 A450nm-B          0.125         0.096        23         2 A450-620nm         0.130         0.090        23         2 A450-620nm-B        0.203         0.102        22         3

      由表2结果可见，由于所选择的为临界值样本，不同波长的选择可能会导致部分检测孔阴阳性结果发生改变。

定性分析的临床意义在于是否检出病原体而与检出量无关。ELISA定性分析中，对于较高浓度的样本，一些外在因素的影响有时尚不足以影响对结果的判断，低浓度样本则不然，无论是非特异性反应如溶血、脂血、标本污染等因素的影响^[1，2]，还是不同检测方法之间的差异^[3]，甚至同一种检测方法初复检^[4]或是加样时差等^[5]均有可能造成结果的改变。目前关于波长选择对临界浓度检测样本影响的报道相对较少，但影响是存在的如邱娜使用单波长比色孔间的CV>3%,双波长比色孔间CV<3%,原因在于次波长消除了非特异因素的影响^[6]。

酶标比色计的主波长检测的是特异性反应与非特异性反应的吸光度A值之和，大小通常与样本中反应物的浓度成正比。为了减少非特异性显色对检测结果的影响，在比色时常常选择一个次波长如630nm，以两者吸光度A的差值来判定检测结果。由于两种不同波长对非特异性反应的吸收峰不一，当A_630nm>A_450nm时常会导致部分样本检测孔、N孔与B孔的A为负数，对于如HBsAg等检测项目，由于N孔的吸光度A值若<0.05通常也以0。05计，故B孔的负数虽不会导致高浓度样本结果的改变，但对低浓度样本结果会产生影响。

本文所选择的几种比色方法中，使用A_450nm进行比色，当N一定时，若不减去试剂空白（B）可能导致A_450nm值的上升使阳性增加。使用A_450nm-B可减去试剂空白或空气空白，但不同检测孔之间存在的差异可能无法消除（A_620nm值不同），但该法比色时空白孔不会产生负数。A_450-620nm方式采用了双波长比色，相对克服了非特异性反应的影响，尽管空白孔可能会为负数，但由于是以N孔的A值计算CO值，因而不会影响检测结果。A_450-620nm-B方式当B孔A为负数时，若以样本检测孔A值减空白孔会使检测孔的A值增加从而可能直接导致阳性增加，可见当使用了双波长比色后就不必再减空白孔。由于部分酶标比色计在计算结果时会自动减空白孔，应引起操作人员的高度重视。

[1] 龙宪和，童华城．溶血对乙型肝炎五项血清标志物检测的影响[J]．中华医学检验杂志，1996，19(1):47．

[2] 单桂秋，苏建婷．溶血及脂浊样品对ELISA检测乙型肝炎表面抗原的影响[J]．临床检验杂志，1999，17(2):102-103．

[3] 钱厚明，赵江燕，葛小扬，等．HBsAg测定中CO±30%范围内样本的复检分析[J]．中国输血杂志，2003，16(2)：101． 

[4] 钱厚明，赵江燕，张燕． 应重视ELISA检测HBsAg灰区范围内样本的复检[J]．上海医学检验杂志，2002，17(3)：156．

[5] 钱厚明，赵江燕，周樱，等。加样时差对不同试剂检测乙肝病毒标志物的影响[J]．临床输血与检验，2007，9（1）：44-45．

[6] 邱娜．酶标仪单、双波长检测的比较[J]．临床输血与检验，2007，9（1）：61．